40-летний Эцио Аудиторе да Фиренце поднялся на вершины иерархии ордена после окончания событий игры Assassin's Creed II. Отомстив убийцам отца и братьев, он покинул Рим и наслаждается жизнью на своей вилле. Некогда могучий Рим лежит в руинах. Город полон страданий, его граждане живут в тени беспощадной семьи Борджиа. Лишь один человек способен освободить людей от тирании – Эцио Аудиторе, мастер Ассасин. Это приключение послужит испытанием его способностей. Чезаре Борджиа, более опасный и злобный враг, чем его отец Родриго, не успокоится, пока не захватит всю Италию. В эти ужасные времена повсюду царят заговоры, даже в рядах самого Братства.

В качестве главной новой угрозы, которая зарится на последнее пристанище людей, числится группировка «Кабал», с кем мы впервые столкнулись ещё в оригинале. По сюжету даже логически объяснили, почему стражи потеряли свой «шмот»: враги внезапно атаковали цитадель и уничтожил хранилище.

Продолжая события первого Assassin’s Creed, вторая игра серии погружает нас в Италию эпохи возрождения. Похищенному Дезмонду Майлсу грозит отойти в мир иной из — за несовершенства используемой на нем машины «Анимус». Люси Стиллман вместе с двумя героями нынешнего времени, освобождают горе бармена из плена злой корпорации. Дезмонд узнает, что современное братство ассасинов, так же создали машину для извлечения генетических воспоминаний, но признаков шизофрении, после ее частого использования, у главного героя наблюдаться не будет.Стоит заметить, что от постоянного нахождения в Анимусе, созданном в Абстерго, у потомка ассасинов, в результате некоего «эффекта просачивания», стали проявляться способности его предков. Используя эффект просачивания и следуя по воспоминаниям еще одного предка Дезмонда — Эцио Аудиторе да Фиренце, братство ассасинов предлагают главному герою развить личные навыки в мастерстве бесшумных и не очень убийств, а так же отыскать когда – то потерянные Частицы Эдема.